Frequently asked questions
DIAプロテオーム解析・全般
DIA解析法とiTRAQ法の詳細な技術的な違いは何ですか。
【iTRAQ法】
MS-1、-2、-3の違いは、発現量の観点からの検出感度以外に、何かありますか。
MS-1でも検出可能な発現量のタンパクに関しては、定量精度は変わらないでしょうか。
簡易・標準・高深度解析の違いは基本的には検出感度の違いとなっており、簡易・標準・高深度解析の順で観測されるタンパク質が増加します。また、簡易DIAプロテオーム解析でも検出可能な発現量のタンパク質においても標準、高深度解析と分析深度が高い方が定量精度はよくなります。分析深度が高くなると１つのタンパク質について定量値を算出するペプチドの数が増えますので、その分定量精度が良くなってきます。
ハカレル社受託サービスの次世代型解析の特徴は、高感度にタンパク質を同定できることでしょうか。そうであれば、5μgのタンパク量が必要とありますが、より少量（1μg程度）のタンパク量でも、通常の解析ができると考えて宜しいでしょうか。
DIAプロテオミクスの最大の特徴はサンプル間の定量比較ができるところにあります。また、ご指摘のように高感度であるので多くのタンパク質を解析することができることも大きな特徴です。エクソソームサンプルにおいて、精製純度の高いエクソソームが５μgあれば最低2000種類のタンパク質を解析できますが、タンパク量が少なくなると解析できる種類が減り、1μg程度の蛋白量では数百種類の蛋白しか解析できないことがあります。新規バイオマーカーの多くは発現量の低いタンパク質ですので、十分量を解析にかけて、稀少タンパク質の定量解析から新たなバイオマーカーを見出すことでDIAプロテオミクスの特徴を活かせるものと考えております。
DIAプロテオーム解析・サンプル
サンプルの必要量と、最低限どれくらいの濃度が必要でしょうか。
サンプル量に関しては分析メニューに応じて以下の通りになります。
- （簡易）DIAプロテオーム解析の場合：必要最低限のタンパク量 5μg
- 高深度DIAプロテオーム解析の場合：必要最低限のタンパク量 10μg
必要最低限のサンプル量とは本受託でベストな解析を行うための量で、それよりサンプル量が少なくても分析を引き受けます。だたし、サンプル量が少ないほど観測できるタンパク数は減少してしまいます。
タンパク濃度に関しては100ng/μL以上であることが望ましいです。これ以下の場合はサンプルチューブへの吸着等でタンパク質を大きく損失する可能性があり、プロテオーム解析の結果にも影響が出る可能性があります。
超遠心法でエクソソームを分離した場合血清中の蛋白の影響はないのでしょうか。
血清中のエクソソームでも分析可能です。超遠心で落とすだけでは血清中の夾雑蛋白がかなり混入してくるので、それらを除く工夫が必要になります。当社では、ご提供いただいた血清サンプルからスクロース・クッション超遠心法でエクソソームを調製し、プロテオミクス解析まで行います。
例えばヒト細胞の培養上清サンプルを解析する場合、FBS が入っているとプロテオーム解析は困難なのでしょうか。質量分析でエクソソーム中のヒトとウシ由来のタンパクは区別できるのではないかという疑問です。
ヒトとウシのタンパク質データベースを用いて同定解析することで、ヒトとウシ由来のタンパク質を区別することは可能ですが、ターゲットではないタンパク質の存在は詳細な分析の妨げになる可能性がありますので、培養条件としてFBSが不可欠である場合はエクソソームを除去したFBSを利用されることをお薦めします。
無血清培地 AIM V™ Medium (Thermo Fisher社)で培養しています。この培地には蛋白が含まれますが、測定は可能でしょうか。
血清アルブミンのような大量の夾雑タンパクでない限り測定は可能です。超遠心で落としたエクソソームを一度PBSでしっかりボルテックスで洗浄し、再度超遠心で落とすことにより培地由来のタンパクはかなり除去できます。
カニクイザル（cynomolgus monkey）の初代培養細胞から精製したエクソソームのプロテオミクス解析は可能でしょうか。
カニクイザルのタンパク質データベースがありましたので解析は可能です。
エッペンドルフ社のセーフロックチューブ（1.5mL）の使用を強く推奨するのは、このチューブにはエクソソームが吸着しにくいからでしょうか。
エクソソームの吸着よりもチューブの汚れが問題になります。チューブの種類によってはLC-MSで汚れが検出されてしまうケースがあるため、汚れの少ないことが分かっているセーフロックチューブを推奨しています。
エクソソームを抽出するに当たり、血清を冷凍保存することは特に影響ないでしょうか。
血清は冷凍保存で大丈夫です。できればマイナス80℃が望ましいです。
細胞培養液を依頼する予定ですが、100mlを超遠心するのに当施設の設備では時間がかかります。試料の保存・輸送は冷蔵より凍結が推奨でしょうか? また、凍結の場合、蒸留水中保存で何回まで凍結融解は可能でしょうか。
培養液、精製エクソソーム、いずれのサンプルをご出検いただく際でも、凍結せず冷蔵で保存・輸送するようお願いいたします。特に精製エクソソームの凍結保存は避けて下さい。
通常、PBSでエクソソームを超遠心法で抽出しています。LC-MSグレード蒸留水で試料の調製ということですが、PBSの場合と比較して、操作や試料の保存に留意すべきことはありますでしょうか?
操作につきましてはPBSの場合と同様にして頂いて問題ありません。保存についてはエッペンドルフ社のセーフロックチューブ（1.5mL）の使用を強く推奨しております。また、PBSで調製されたサンプルであっても、サンプルクリーナップ処理を同時にご指定いただけば、普段お使いのチューブでも蒸留水と同レベルの結果をお出しできます。
クリナップ処理とは具体的にはLC-MSグレードの蒸留水で透析処理されるのでしょうか。
クリナップ処理は有機溶媒沈殿、TCA沈殿法、HILIC系ビーズを用いた方法などを使用しています。どの方法を選択するかはサンプルの溶液の種類、液量、濃度によって決めています。透析は損失が大きく、サンプルも濃縮できないので使用していません。
エクソソーム・サンプルは通常PBSに懸濁して調製しますが、プロテオミクス解析に供する場合、オプションとして設定されているサンプルのクリーナップ処理も依頼が必要となりますでしょうか。
基本的には溶液サンプルはクリナップ処理を薦めていますが、液量が50μL以下でLC-MSグレードの蒸留水で作製したPBSならばクリナップ処理なしでも大丈夫です。また、PBSの代わりにLC-MSグレードの蒸留水でエクソソームを懸濁していれば、液量がある程度増えてもクリナップ処理なして対応できます。
有機溶媒で沈殿させる際も、膜成分を界面活性剤で壊してから、濃縮させた方が良いなどあるでしょうか。
実際に検証したわけではないので詳細は分かりませんが、膜成分を界面活性剤で壊しても壊さなくても有機溶媒沈殿の結果はそこまで変わらないと考えております。サンプルクリーナップからのご依頼を受けた時は、TCA沈殿やアセトン沈殿の再溶解が難しいことがありますので、可溶性の高い界面活性剤の入った抽出液を入れて、高出力の超音波破砕機によって念入りに可溶化しております。
「可溶性の高い界面活性剤の入った抽出液を入れて、高出力の超音波破砕機によって念入りに可溶化」とありますが、どのような界面活性剤なのでしょうか。
当受託では0.5-1%程度のドデカン酸ナトリウム(CAS No: 629-25-4)を使用しております。この界面活性剤はSDSと同等レベルの可溶性をもち、比較的トリプシン消化の妨げにもならないので使用しております。ショットガンプロテオーム解析を行わないのであれば、2-4%程度のSDSによる溶解でも問題ないと考えております。
いずれのMSも、Thermo Fisher Scientific 社製 Total Exosome Isolation Reagent (from serum)
といった超遠心以外の抽出試薬でサンプル調製しても問題ないでしょうか。
すべての抽出試薬で検討したわけではありませんので問題ないとは申し上げられません。おそらく試薬によってエクソソームの純度にもバラつきがあると考えられますので、Total Exosome Isolation Reagent (from serum)を含め、ご依頼の際にはMS-4（サンプルクリーナップ処理）も合わせてお申し付けいただくことをお勧めいたします。
エクソソームの単離はこちらで行いたいと考えています．今のところ、MagCapture（富士フィルム和光純薬）による単離、または、抗体によるプルダウンを考えていますが、これらで精製したエクソソームのプロテオミクス解析は可能でしょうか（MagCaptureおよびプルダウンに用いた試薬のコンタミは，解析する上で気にしなくて宜しいでしょうか）。
当方では基本的に超遠心により精製したエクソソームを使っており、MagCaptureや抗体のプルダウンによるサンプルはあまり経験がございません。しかしながら、MagCaptureの場合にはトラップされたエクソソームはキレート剤によって回収しますので、回収後にキレート剤を除去すれば解析は可能であるはずです。一方、抗体によるプルダウンでは抗体と結合したエクソソームを外しても抗体蛋白を除去するのは困難ですので、プロテオミクス解析には不適であると考えられます。
エクソソームをトリプシン処理し、表面のタンパク質をshavingしてプロテオミクス解析をすれば、表面抗原が同定できると思いますが、御社でこの手法による解析は可能でしょうか。
トリプシン消化したエクソソームから遊離するペプチドは精製が困難ですので、そのような解析は当方では出来かねます。
DIAプロテオーム解析・発注
MS解析の納期はどれくらいでしょうか。
基本的にはサンプルを受け取ってから、4週間を納期としています。
注文に際し、仕様書を研究施設に提出する必要があります。サンプル受領後の作業内容を箇条書きでお知らせいただけないでしょうか。
1. 受け取ったサンプルから超音波破砕機を用いてタンパク質を抽出
2. BCAアッセイによるタンパク質濃度測定
3. 抽出したタンパク質を還元・アルキル化処理
4. トリプシンを用いてタンパク質を消化
5. C18スピンカラムを用いて脱塩
6. データ非依存的分析(DIA)によるMS測定(使用する質量分析計：Q Exactive HF-X, Thermo Fisher Scientific社)
7. 得られたMS測定結果からScaffold DIA(Proteome Software社）を用いてタンパク質同定ならびに定量の算出
8. Scaffold DIAの解析データをExcelファイルにエクスポートし、データの整備
品番MS-1はMS-2と比較して、蛋白量の少ないものが測定できないという理解でよろしいでしょうか? どちらのオーダーが多いでしょうか?
そのご理解で結構です。オーダー数はMS-2が多いですが、お試し実験であればMS-1から始められてもある程度のデータは得られます。
DIAプロテオーム解析・データ解析
一覧にない蛋白は全てのサンプルで検出できなかったということでしょうか。
リストになかったタンパク質は検出できなかったということです。
結果の値の単位を教えてください。
MS強度をもとに算出された値で特に単位はありません。
ノーマライズの方法を教えてください。
MS測定で得られる総イオン強度(TIC)でノーマライズしております。タンパク量でノーマライズした感覚に近いです。
定量はペプチドのスペクトルのピーク検出強度だと思いますが、数値としてどのように10の3～7乗程度のオーダーになっていくのでしょうか。
同定されたペプチドのフラグメント(MS2)スペクトルのクロマト面積値の総和がペプチド定量値となり、同定されたタンパク質に対してユニークな配列を持つペプチド定量値の総和がタンパク質定量となっています。Excelで示した定量値はタンパク質定量となっています。
例えば5種のサンプルのうち２種で発現量の上がっている膜タンパクを知りたいといったような場合、何千ものタンパクのデータをエクセルでもらっても自力で解析できないので、どうすればよいでしょうか。
フリーウェア解析用ソフトのScaffold DIAでもご要望のようなセレクションをかける機能はありません（このソフト以外でもニーズにこたえる機能はありません）。多くの方はエクセルを用いて自力でデータ解析されていますが、コントロール・サンプルの定量値でそれぞれのサンプルの定量値を割って、エクセルのフィルター機能を使えばある程度簡単にデータを選択できます。
検出した蛋白をUniprotのKeyword Biological Processのように大きな分類分けをしたいと思っています。Uniprotではひとつづ入力して調べないといけません。どこかのWEBサイトで一覧を入力すればKeyword Biological Processを返してくれるようなツールはご存知ないでしょうか。
DAVID Bioinformatics Resourcesの以下のサイトで解析ができます。
https://david.ncifcrf.gov/
エクソソームの表面抗原を選出したいと考えています．ハカレル社の解析データから、インフォマティクスの情報（膜蛋白質のトポロジー）に基づいて表面抗原を選出することは可能と思われますか。
GOアノテーションでPlasma membraneというカテゴリがありますので、DIAプロテオミクス解析で観測されたタンパク質に対してPlasma membraneのフラグを付けることは可能です。
特定のタンパクの発現量をサンプル間で比較するには、解析結果のエクセル・ファイルに示されている各タンパクの数値について、サンプル間で割り算をすればよいのでしょうか。例えば、サンプルAとBでタンパクXの数値がそれぞれ20と5であれば、タンパクXはサンプルBに比べサンプルAで4倍発現量が多いと考えてよいのでしょうか。
その考えで問題ありません。
数値を比較する場合、差や比を使用してもよろしいでしょうか?。測定値はリニアですか。
同一のタンパク質に対する数値の比較は行えますが、ペプチド断片ごとにイオン化効率が大きく異なるため、異なるタンパク質との数値の比較は基本的はできません。同一のタンパク質内での数値に対しては差や比を使用しても問題ありません。また、同一のタンパク質内の値はリニアとお考え下さい。
蛋白間の比較はできないということでしたが、まったく比較できないのでしょうか。例えば、係数をかけるとある程度比較できるとか、100倍違っていればおそらく違いがあるとかなどがあれば教えてください。
タンパク間を比較するための簡単なノーマライズとして定量値を分子量で割ってください。その値がオーダーレベルで違いがあれば、違いとして考えてもよい思います。
異種の蛋白同士での相対的な定量意義はありますか
ペプチドの種類によってイオン化効率が大きく異なり、異なるタンパク質同士の正確な比較を行うことはできません。ただし、定量値が大きいほど存在量が多い傾向はあることは事実のです。もし、タンパク間の比較を行いたい場合は定量値をタンパク質分子量で割って、ノーマライズすることをお薦めします。それでも参考値程度にお考えください。
3サンプルを比較する場合、どれくらいの差、比の違いがあれば違いがあるといえるのでしょうか。また、測定の誤差の範囲を教えてください。
当受託でのテストでは観測されたタンパク質の90%以上に対して定量値の再現性がCV20%以内に収まっておりますが、測定でばらつきが生じるのも事実で数値が小さいほどばらつきが大きくなる傾向があります。n=1の測定の場合には、ばらつきのあるタンパク質を見出すことができませんが、基本的にはペプチド断片数が２以上で比として2倍以上の差があれば違いがある可能性があると考えられます。
解析結果のProtein Group Score は同定されたタンパク質の確度を示すスコアだと思いますが、確度が保証されるようなカットオフ値（0.9以上など）はありますか。
解析結果としてリストアップしたタンパク質は統計的に問題なく同定されたといえるタンパク質です。特にカットオフ値を設ける必要はございません。
解析結果にはMS データから算出されたタンパク質の定量値が示されていますが、この定量値もまた何らかのカットオフ値がありますか（x10の4乗以上など）。
一般的なプロテオーム解析のデータの取り扱いとしては特にカットオフ値を設けておりませんし、当社で解析している場合もカットオフ値は設けておりません。定量精度を求めるのであれば、ここでカットオフ値を設定するよりかはIdentified Peptide Countでカットオフ値を設定した方が一般的な信頼性は高くなります。
解析結果の Identified Peptide Count はタンパク同定に用いられた ペプチド数に相当すると思いますが、このペプチド数の大小は重要になりますか。
観測ペプチド数が多いと定量に用いたペプチド数も多くなるため、定量性精度が高くなります。ペプチド数が少なくても比較解析に使えるように定量性の高いプロテオーム解析手法を取っていますが、より確実な定量結果を選択したい場合はペプチド数の多いタンパク質に着目することがよいかと思います。
プロテオーム解析の結果、発現量に差がみられた蛋白についてウェスタン解析しましたが、まったく差が見られませんでした。何かコメントなどお願いします。
ウェスタンブロット（WB）とプロテオーム解析結果がマッチしないことは時々起こる現象です。発現量の低いタンパク質に関しては測定値のばらつきも大きくなる傾向があります。比較的発現量の多いタンパク質の場合、プロテオーム解析結果がマッチしなかった理由として考えられるのはプロテオーム解析では酵素によってペプチド断片化して質量分析しており、必ずしも全長のタンパク質を解析しているわけではない点です。もともとのサンプルで断片化や分解されたタンパク質が含まれているとプロテオーム解析結果に影響を与え、全長を見るWBとの結果と相関しないことが起こります。
また、n=1の解析では、対象となっているタンパク質の安定性については分かりませんが、タンパク質の種類によっては処理の日によってばらつくものや保存状態によって大きく減少するものも存在しますので、それが原因でWBとプロテオーム解析結果がマッチしない可能もあると考えられます。
質量分析とWBの乖離についてはサンプル中の断片化されたタンパク質との区別がつかないという問題点はショットガンプロテオーム解析の本質的なところなので、DIAプロテオーム解析でも改善されていません。ただし、従来のプロテオーム解析(DDAプロテオーム解析）よりDIAプロテオーム解析では同定に用いているMS2スペクトルを用いて定量解析を行っているため、間違った定量値を算出することが格段に減少しております。その意味ではWBとの乖離もある程度解消できていると考えております。
TCAでタンパク質を沈殿濃縮後に、エクソソーム画分のプロテオーム解析を行ったとき、CD抗原がほとんど検出されなかったことがあります。同じサンプルをウェスタンブロットした時は（TCA沈殿なし）強いバンドが検出されています。TCA沈殿でエクソソーム等の膜局在タンパク質の濃縮に差があるなどの情報あるでしょうか。
TCA沈殿や有機溶媒沈殿などの場合は再溶解が難しく、タンパク質の種類によってもその再溶解の難しさは変わってきます。ですのでエクソソーム特有の問題ではないと考えられますが、基本的に溶解が難しい膜タンパクの塊であるエクソソームだと再溶解の影響が大きく出た可能性があります。